前 言
非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種在豬之間的烈性傳染病。目前，該疾病已被列為必須向世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）報(bào)告的嚴(yán)重疾病。自非洲豬瘟爆發(fā)以來，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了難以彌補(bǔ)的經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)也不例外。為了防治非洲豬瘟帶來的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)影響，控制和根除非洲豬瘟至關(guān)重要。疫苗接種是預(yù)防和控制非洲豬瘟擴(kuò)散的最佳策略，但由于當(dāng)前的非洲豬瘟病毒滅活疫苗的保護(hù)性差，并且沒有足夠高效的體外ASFV復(fù)制生產(chǎn)的細(xì)胞系，給豬瘟疫苗的有效推廣蒙上了陰影。因此仍然需要開發(fā)具有高免疫保護(hù)潛力且易于擴(kuò)大化生產(chǎn)的非洲豬瘟疫苗。
非 洲 豬 瘟 病 毒
非洲豬瘟病毒具有二十面體對(duì)稱性，直徑為260 nm，呈同心圓結(jié)構(gòu)，分為病毒核心，核心殼層，雙層內(nèi)膜，衣殼，外囊膜等5層。
圖一：非洲豬瘟病毒顆粒結(jié)構(gòu)圖
ASFV基因組長(zhǎng)度在170-190kb，包含可變數(shù)量的開放閱讀框架(ORFs)，范圍從160到175個(gè)，可編碼150-200個(gè)病毒蛋白，包括68個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和100多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。
圖二：非洲豬瘟病毒顆粒編碼基因
ASFV形態(tài)發(fā)生在高爾基體和微管組織中心附近的核周病毒工廠，病毒組裝的第一個(gè)跡象是從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池中形成病毒膜前體，衣殼逐漸組裝后，這種病毒膜前體成為多面體中間體。隨著衣殼的形成，病毒核心在病毒的內(nèi)膜下組裝，然后細(xì)胞內(nèi)的成熟病毒工廠被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，并通過從質(zhì)膜出芽離開宿主細(xì)胞相對(duì)于其他病毒來說，非洲豬瘟病毒更為復(fù)雜，體型也非常巨大，其生物學(xué)機(jī)制也相對(duì)復(fù)雜。
圖三：非洲豬瘟病毒顆粒感染過程與原理
2019年，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所饒子和/王祥喜團(tuán)隊(duì)和哈爾濱獸醫(yī)研究所步志高團(tuán)隊(duì)聯(lián)合上海科技大學(xué)、清華大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所、南開大學(xué)等單位，合作在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊 Science 上發(fā)表了題為 Architecture of African Swine Fever Virus and implications for viral assembly（非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)及裝配機(jī)制） 的學(xué)術(shù)論文，率先解決了這一世界級(jí)難題，為后續(xù)的科學(xué)研究和藥物疫苗提供了足夠的理論基礎(chǔ)。
圖四：非洲豬瘟病毒與其他病毒顆粒
ASF 疫 苗 開 發(fā)
ASF疫苗僅在國(guó)內(nèi)就擁有超過10億頭的市場(chǎng)容量和百億級(jí)別的市場(chǎng)規(guī)模。在滅活疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗、載體疫苗以及核酸疫苗上近年來均有不同的進(jìn)展。
Walczak等人通過分析從ASF存活動(dòng)物身上收集的血清中和ASFV的可能性，指出抗ASFV抗體本身并不能抑制病毒復(fù)制。研究人員指出，這可能是由于ASFV特異性抗體并不能中和病毒：雖然滅活疫苗具有抗原性，但不能引起完全的細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致保護(hù)并不完全，將滅活的ASFV用作疫苗可能不切實(shí)際。Pikalo等人通過給斷奶仔豬接種疫苗，42天后再接種高致病力的“Armenia-2008”毒株，證明滅活疫苗免疫對(duì)高致病性的“Armenia-2008”ASFV 毒株沒有保護(hù)，雖然實(shí)驗(yàn)表明接種滅活疫苗的動(dòng)物體內(nèi)含有特異性IgG，但沒有保護(hù)作用。上述試驗(yàn)獲得了類似的結(jié)論，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)證明使用現(xiàn)有方法開發(fā)有效的ASFV滅活疫苗存在挑戰(zhàn)。
2022年6-8月，越南與美國(guó)共同開發(fā)的減活疫苗在臨床生產(chǎn)使用時(shí)出現(xiàn)較多接種后生豬死亡，這個(gè)結(jié)果給減活疫苗的研發(fā)蒙上了陰影。但是，目前哈爾濱獸醫(yī)研究所在研的ASFV-7GD減活疫苗已在黑龍江、新疆和河南三個(gè)養(yǎng)殖基地開展臨床試驗(yàn)，備受關(guān)注；普萊柯與中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所合作的亞單位疫苗也已向農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提交獸藥應(yīng)急評(píng)價(jià)材料；華中農(nóng)大與企業(yè)進(jìn)行合作研發(fā)的基于病毒載體的ASFV疫苗也即將完成轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)。
在mRNA疫苗開發(fā)方面，默沙東動(dòng)物集團(tuán)推出的Sequivity IAV-S NA打響了獸用疫苗的第一槍。目前，國(guó)內(nèi)外已有企業(yè)陸續(xù)公布關(guān)于ASF相關(guān)mRNA疫苗研制的計(jì)劃或進(jìn)展：美國(guó)Genvax公司與農(nóng)業(yè)部合作開發(fā)saRNA疫苗；金宇保靈去年底與上藍(lán)鵲生物簽訂《ASF mRNA疫苗合作開發(fā)等等。
無論是從哪條途徑去開發(fā)非洲豬瘟相關(guān)病毒。深入研究ASFV基因組學(xué)和不同基因的功能（包括與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因）對(duì)于開發(fā)ASF疫苗都至關(guān)重要：P30、P54、P72、CD2v、EP153R等結(jié)構(gòu)蛋白屬于ASFV最重要的一類保護(hù)性抗原蛋白，其中P54和P72均與病毒吸附有關(guān)；其中P30參與病毒入侵；CD2V參與紅細(xì)胞與感染細(xì)胞和細(xì)胞外病毒的結(jié)合，并與免疫逃逸相關(guān)；EP153R則可與MHC-I抗原呈遞調(diào)控有關(guān)；同時(shí)P72蛋白組裝需要B602L編碼分子伴侶的協(xié)助。
圖五：非洲豬瘟病毒顆粒相關(guān)重要基因
目前發(fā)現(xiàn)可用于制備降低ASFV毒力減活疫苗的相關(guān)獨(dú)立基因并不多，有I177L、9GL、CD2v、A137R、I226R、I267L、NL、UK 和DP148R 等，但是并沒有有效可行的商品化疫苗問世。因此發(fā)現(xiàn)和表征新的毒力決定基因?qū)τ诤侠黹_發(fā)下一代減毒活疫苗候選株至關(guān)重要。
由于易感動(dòng)物在接觸ASFV后會(huì)迅速死亡，以往的調(diào)查無法確定病毒與宿主之間的聯(lián)系。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，滅活疫苗會(huì)導(dǎo)致疫情進(jìn)一步擴(kuò)大，減毒活疫苗會(huì)導(dǎo)致免疫豬持續(xù)感染、排毒和副作用，而ASFV感染是否會(huì)產(chǎn)生中和抗體仍存在爭(zhēng)議。此外，不同毒株之間的交叉保護(hù)率很低，這使得篩選候選疫苗具有挑戰(zhàn)性。根據(jù)Qu及其同事的解釋，這可能有助于確定疫情中病毒的來源，并有助于ASF疫苗的開發(fā)。到目前為止，豬和生物安全三級(jí)（BSL-3）實(shí)驗(yàn)室限制了疫苗的廣泛開發(fā)，因此很難獲得可靠的動(dòng)物模型來評(píng)估疫苗的免疫效果。大量研究總結(jié)了用于確保疫苗接種安全性和評(píng)估在實(shí)驗(yàn)中使用動(dòng)物可行性的程序。不幸的是，最近中國(guó)農(nóng)場(chǎng)出現(xiàn)的減毒株導(dǎo)致了慢性疾病、豬群臨床副作用和工業(yè)威脅。
除了使用多種 ASFV抗原或抗原片段以及優(yōu)化佐劑和化學(xué)制劑的選擇外，還應(yīng)關(guān)注現(xiàn)有毒株的保護(hù)性抗原及其理想的免疫機(jī)制。疫苗始終是預(yù)防和控制ASFV的基本策略和最佳工具。未來對(duì)ASFV病毒學(xué)和功能基因組學(xué)的研究將集中在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、感染和免疫機(jī)制、作為免疫原的其他保護(hù)性抗原的鑒定、增強(qiáng)免疫保護(hù)的疫苗目標(biāo)以及在目標(biāo)動(dòng)物中的全面測(cè)試等主題上。安全性和免疫效果也應(yīng)在未來的研究中進(jìn)行評(píng)估。
非洲豬瘟疫苗新方向——細(xì)胞免疫
由于大多數(shù)滅活疫苗提供的保護(hù)非常有限，對(duì)于非洲豬瘟的積極控制現(xiàn)在主要還依賴于改良性活病毒疫苗（MLVs）的開發(fā)。盡管保護(hù)的相關(guān)因素尚未完全理解，但改良活疫苗（MLVs）被廣泛人為可以很好的用于預(yù)防和治療。不過，它們確實(shí)也存在某些限制和風(fēng)險(xiǎn)，包括對(duì)異源PRRSV株的保護(hù)有限和潛在的回復(fù)毒力，特別是滅活疫苗效果不佳也會(huì)對(duì)異源的保護(hù)力弱；同時(shí)，中和抗體一般在感染后期才會(huì)出現(xiàn)，也給相關(guān)的防控效果帶了不利因素。
PRRSV一般會(huì)在體液和細(xì)胞兩個(gè)方面調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，從而來調(diào)控免疫抑制以及繼發(fā)性感染與擴(kuò)散，受到感染的動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)出延遲的中和抗體反應(yīng)以及干擾素(IFN)分泌的中斷，從而有利于病毒的復(fù)制和傳播。PRRSV同時(shí)還降低了感染細(xì)胞中MHC-I的表達(dá)，有效抑制新生抗原的呈遞以及后續(xù)細(xì)胞免疫對(duì)于病毒感染的擴(kuò)散。
在豬體內(nèi)，MHC-I存在三個(gè)經(jīng)典的I型豬白細(xì)胞抗原復(fù)合體(SLA-I) 基因（SLA I-1/2/3）編碼的分子，并能夠在所有的有核細(xì)胞上表達(dá)。這些細(xì)胞表面蛋白結(jié)合并呈遞抗原給CD8+ T細(xì)胞，以引起細(xì)胞毒性反應(yīng)。此外，CD8+ T細(xì)胞記憶的產(chǎn)生保護(hù)宿主免受復(fù)發(fā)性感染。在未受感染的細(xì)胞中，MHC-I呈遞內(nèi)源性肽，主要是胞質(zhì)肽，以信號(hào)顯示它們未被感染。大多數(shù)CD8+ T細(xì)胞表位由免疫蛋白酶體產(chǎn)生，這是一種ATP依賴的蛋白酶復(fù)合體，它裂解泛素化的蛋白質(zhì)。然而，還存在其他抗原加工途徑，包括自噬和由furin及信號(hào)肽肽酶的蛋白質(zhì)裂解。經(jīng)典的蛋白酶體衍生肽由與抗原加工相關(guān)的ATP依賴蛋白復(fù)合體稱為轉(zhuǎn)運(yùn)體，即TAP1/2，結(jié)合并運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中。在ER內(nèi)，肽由肽裝載復(fù)合體(PLC)裝載到未成熟的MHC-I α鏈上。這個(gè)鏈形成一個(gè)肽結(jié)合槽，并能夠與大多數(shù)長(zhǎng)度為9個(gè)氨基酸（8-12）的肽段結(jié)合。由于空間阻礙，更長(zhǎng)的肽很少被結(jié)合。一旦MHC-I分子裝載完成，它就獲得了成熟構(gòu)象，從PLC解離，并被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面，向CD8+ T細(xì)胞呈遞抗原。這些T淋巴細(xì)胞識(shí)別呈遞抗原的細(xì)胞為感染細(xì)胞，并啟動(dòng)細(xì)胞溶解過程，包括產(chǎn)生和分泌細(xì)胞毒性顆粒和細(xì)胞因子，如干擾素γ(IFNγ)和腫瘤壞死因子α(TNFα)。
圖六：MHC分型
因?yàn)榭贵w反應(yīng)通常不足以清除病毒，CD8+ T細(xì)胞被認(rèn)為可能是另一個(gè)重要的非洲豬瘟病毒保護(hù)相關(guān)因素。迄今為止，已有幾項(xiàng)研究調(diào)查了隨機(jī)生成或預(yù)測(cè)的PRRSV衍生肽的免疫潛力，然而，目前尚不清楚這些肽是否在體內(nèi)合成并被真實(shí)的提呈到細(xì)胞表面并從而引起免疫反應(yīng)。免疫蛋白酶體通常在疏水性和堿性氨基酸后切割蛋白質(zhì)，因此，某些預(yù)測(cè)或隨機(jī)產(chǎn)生的肽是否在細(xì)胞內(nèi)被合成并呈遞，還需要通過實(shí)驗(yàn)來確定。
研 究 方 法
細(xì)胞免疫研究的核心問題是首先要識(shí)別由MHC-I（I類主要組織相容性復(fù)合體)結(jié)合的病毒肽段，并確認(rèn)它們具有很好的刺激CD8+ T細(xì)胞的能力。
基于這樣的出發(fā)點(diǎn)，研究人員：
1、從PRRSV（株AUT15-33）感染的細(xì)胞（SLA-I Lr-Hp）中免疫沉淀MHC-I/肽復(fù)合物，以分離病毒表位，并使用液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）進(jìn)行分析。
圖七：MHC復(fù)合物提取富集
利用抗MHC-I抗體PT85A對(duì)非洲豬瘟來源樣本的裂解液進(jìn)行MHC-I復(fù)合物，進(jìn)行富集；富集產(chǎn)物使用SDS-PAGE分析富集情況，然后進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。用親和素-HRP檢測(cè)生物素標(biāo)記的細(xì)胞表面蛋白，確認(rèn)成功分離了45 kDa的MHC-I α鏈和12 kDa的β2微球蛋白分子，并且沒有其他細(xì)胞蛋白的主要污染（見圖七）。對(duì)照IgG進(jìn)行的免疫沉淀也顯示出細(xì)胞裂解液中沒有非特異性結(jié)合。
以未被感染的細(xì)胞作為對(duì)照，利用被PRRSV菌株AUT15-33感染的豬巨噬細(xì)胞（PAMs）進(jìn)行免疫肽組分析，研究人員發(fā)現(xiàn)PRRSV感染會(huì)導(dǎo)致MHC-I的下調(diào)。通過免疫熒光確認(rèn)了細(xì)胞的成功感染情況；收獲后，通過免疫沉淀分離了MHC-I/肽復(fù)合物。洗脫樣品通過LC-MS/MS分析，獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與AUT15-33和Sus scrofa兩個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示：對(duì)未感染的PAMs樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)庫研究，這些樣本與Sus scrofa蛋白質(zhì)組匹配，共鑒定出2387個(gè)肽組，肽鏈長(zhǎng)度在7到13個(gè)氨基酸之間，絕大多數(shù)（63.64%）是九肽（圖八-a）。
圖八：MHC復(fù)合物提取富集
這些發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)一致，表明大多數(shù)MHC-I結(jié)合肽的序列長(zhǎng)度為九個(gè)氨基酸。此外，已知表位錨定殘基傾向于是疏水性或堿性氨基酸。數(shù)據(jù)也證實(shí)了在9肽的錨定殘基（位置2和9）處疏水性氨基酸的保守性（圖八-b）。
圖九：免疫肽相關(guān)蛋白質(zhì)在ORF1中位置
值得注意的是，把采集的免疫肽組質(zhì)譜數(shù)據(jù)與AUT15-33蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，研究人員檢測(cè)到了來源于ORF1的多個(gè)編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（NSPs，表1，圖九）來源的免疫肽組結(jié)果：其中七個(gè)免疫肽段與四種病毒蛋白酶相匹配——NSP1α、NSP1β、NSP2和NSP4，一個(gè)肽段來自跨膜蛋白NSP5，另一個(gè)來自NSP8，四個(gè)肽段與NSP9相匹配，即病毒RNA依賴性RNA聚合酶。為了確認(rèn)通過LC-MS/MS獲得的病毒肽序列的正確性，研究人員進(jìn)一步對(duì)相關(guān)免疫肽段的免疫原性進(jìn)行了驗(yàn)證。
2、利用這些已識(shí)別的肽段刺激先前感染過PRRSV豬的外周血單核細(xì)胞（PBMCs），并通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（ICS）測(cè)量PRRSV特異性CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)。
表二：細(xì)胞及豬分型信息
研究人員篩選出13個(gè)最可靠的的PRRSV ORF1衍生肽段和兩個(gè)Sus scrofa衍生肽段（C1:ELNDRFANY, C2:KLRDLEDSL）進(jìn)行肽段的合成，并通過體外PBMCs的再刺激和隨后的ICS評(píng)估其免疫原性。ICS相對(duì)于傳統(tǒng)的ELISPOT檢測(cè)具有更低的背景和更高的靈敏度，并且能夠特別篩選CD8+ T細(xì)胞的免疫反應(yīng)情況。研究人員從生物樣本庫中隨機(jī)選擇了23頭仔豬的PBMCs，對(duì)合成的15個(gè)免疫肽段進(jìn)行免疫活性分析：結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，有兩個(gè)免疫肽顯示出較高的免疫活性。低分辨率單倍型（Lr-Hp）分析結(jié)果也顯示，本研究中使用的所有PBMCs與PAMs共享相同的等位基因（表2）。
圖十：免疫原性ICS實(shí)驗(yàn)結(jié)果
為了保證結(jié)果的可靠性，研究人員又利用四批PBMCs對(duì)15個(gè)PRRSV肽段（P1-P13）、2個(gè)內(nèi)源性豬肽段（C1和C2）以及混合肽庫的免疫潛力進(jìn)行體外刺激試驗(yàn)的重復(fù)評(píng)估，同時(shí)，增加了陰性對(duì)照（ACN/DMSO）以及陽性或激活對(duì)照（PMA/ionomycin）。分析結(jié)果顯示，由所有13種MHC-I結(jié)合PRRSV免疫肽肽段等量組成的肽庫，在所有批次中均誘導(dǎo)了CD8+ T細(xì)胞特異性IFNγ反應(yīng)，且比陰性對(duì)照高出5.4至10.5倍（圖十）。在用肽庫重新刺激后，總CD8+ T細(xì)胞群體中有0.69%至1.49%比例的細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性IFNγ，而TNFα或IFNγ/TNFα共激活的CD8+細(xì)胞數(shù)沒有顯著增加。值得注意的是，肽1（P1）在所有批次中顯示出最強(qiáng)的IFNγ反應(yīng)，占總CD8+ T細(xì)胞群體的0.36%至1.26%。從未感染細(xì)胞中分離的MHC-I結(jié)合豬細(xì)胞來源的免疫肽（C1和C2）并沒有誘導(dǎo)IFNγ的產(chǎn)生，證實(shí)了它們的內(nèi)源性特性。
圖十一：免疫原性細(xì)胞分選結(jié)果
此外，我們使用了未激活T細(xì)胞的標(biāo)簽-CD27進(jìn)行染色。在分化為效應(yīng)（記憶）表型的過程中，CD27表達(dá)會(huì)耗盡。在該研究中，用肽庫和單一肽段刺激顯示與陽性對(duì)照PMA/ionomycin相比，未激活或CD27+CD8+T細(xì)胞的頻率更高，PMA/ionomycin是一種強(qiáng)有力的刺激（圖十一）。在PMA/ionomycin刺激的細(xì)胞中，有31.7%至70.1%，在肽庫刺激的細(xì)胞中有43.4%至73.0%，在P1刺激的細(xì)胞中有60.7%至88.9%屬于這種未激活群體。與肽庫和陽性對(duì)照刺激相比，用P1重新刺激的PBMCs中CD27?CD8+細(xì)胞的數(shù)量最低，這代表了一個(gè)高度分化的T細(xì)胞表型。
結(jié)果顯示，混合免疫肽庫比單一肽段表現(xiàn)出更好的T細(xì)胞誘導(dǎo)能力。
結(jié) 論
